Votée après la chute de Combes, grâce à la volonté pacificatrice de Briand et de Jaurès, la loi de séparation des Églises et de l’État est adoptée le 9 décembre 1905. La Ligue de l’enseignement ne joue pas un rôle direct dans le débat qui y conduit, laissant agir les parlementaires ligueurs et son président en titre Ferdinand Buisson (en fonction de 1902 à 1906), qui préside à la Chambre la Commission de la Séparation. Elle attendra le congrès d’août 1907, moment où les passions s’apaisent entre les républicains, pour saluer en présence de Briand une « séparation libérale ». Mais par la suite, tout en souhaitant défendre la loi chaque fois qu’elle paraissait menacée, elle n’en fera pas toujours un axe central de sa stratégie et de sa vision de la laïcité, du moins avant les années 1980-1990. Il est vrai qu’en rendant l’Eglise catholique beaucoup plus libre de ses mouvements que sous le régime concordataire, la loi de séparation lui permettait d’attaquer frontalement l’école laïque et donc de réactiver une guerre scolaire à laquelle la Ligue de l'enseignement se devait d’accorder la priorité : ce schéma s’installe dès les années 1908-1910, où l’on voit des déclarations épiscopales condamner sans partage  « l’école impie » et la Ligue de l'enseignement, parallèlement, forger la posture de la « défense laïque ».